Foco na ciência | Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

Edição 2

Junho, 2020

O avanço do conhecimento científico contribui para o desenvolvimento de novas tecnologias que beneficiam o cotidiano de toda a população. A técnica de Reação em Cadeia de Polimerase, também chamada de PCR, é um ótimo exemplo. Essa metodologia proporcionou avanços na pesquisa científica, principalmente na área de biologia molecular, e também no desenvolvimento de testes diagnósticos e de novos medicamentos.  Na primeira edição do #FocoNaCiência, mencionamos sobre a utilização do RT-PCR como um dos principais métodos de diagnóstico para Covid-19.  Nesta edição, vamos entender o funcionamento básico das técnicas de PCR e de suas variantes RT-PCR e qPCR.

PCR Convencional

Desenvolvida por Kary Mullis na década de 1980, a PCR é uma técnica sensível que consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando a enzima DNA-polimerase, importante para a replicação de material genético dentro das células.

Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material genético: sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers), desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente. Após exposição a altas temperaturas, as fitas complementares de DNA se separam (desnaturação), permitindo o anelamento de primers com suas regiões específicas de cada fita. São os primers que delimitam a porção da fita complementar a ser copiada. Novas modificações de temperatura permitem que a enzima DNA-polimerase inicie sua atividade replicativa a partir do reconhecimento do primer, formando uma fita complementar à sua fita molde de DNA (Figura 1).

Com o auxílio de equipamentos termoclicladores é possível realizar ciclos repetitivos de desnaturação, anelamento e extensão do material, resultando em milhares de cópias da sequência gênica de interesse (Figura 2).

A descoberta da PCR trouxe grandes benefícios e desenvolvimento científico como sequenciamento genético, expressão gênica em sistemas recombinantes, diagnóstico de doenças infecciosas, testes de paternidade e investigações forenses. Sua importância foi reconhecida em 1994 com o Prêmio Nobel de Química.

RT-PCR

A técnica de reação em cadeia de polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR) consiste na técnica de PCR convencional com algumas modificações. Com essa tecnologia, moléculas de RNA são convertidas em DNA complementar (cDNA) através da atividade da enzima transcriptase reversa. Em seguida, os cDNAs recém-sintetizados são amplificadas através dos mesmos procedimentos descritos na PCR convencional. Uma vez que a técnica de RT-PCR permite amplificar amostras de RNA, sua aplicação é muito importante na área diagnóstica para detecção de doenças genéticas, patógenos virais e bacterianos.

qPCR

A técnica de PCR quantitativa (qPCR) utiliza os princípios básicos da PCR com o diferencial que permite a quantificação do material amplificado em tempo real e não apenas no final do processo. Isso é possível graças ao uso de reagentes fluorescentes que emitem sinais a medida que o DNA é amplificado. Equipamentos especializados são capazes de fornecer as condições ideias de temperatura para a amplificação, bem como de detectar os sinais fluorescentes emitidos durante os procedimentos. A grande vantagem da técnica de qPCR é a rapidez na obtenção dos resultados. Além disso, é amplamente utilizada em associação à RT-PCR (qRT-PCR ou RT-qPCR), principalmente na área diagnóstica.

Uma vez que as técnicas de PCR demandam o uso de altas temperaturas, a realização dessas reações requer atenção especial na seleção dos materiais a serem utilizados. Esses cuidados devem envolver desde a seleção dos reagentes (enzimas polimerases, primers e nucleotídeos), até consumíveis plásticos utilizados como tubos, placas, tampas e selos. O uso de materiais impróprios pode interferir liberando inibidores ou contaminantes na reação. Por isso, é sempre importante utilizar materiais confeccionados em plástico homogêneo e com paredes finas para a melhor transferência térmica, com certificação de esterilidade e livres de contaminantes como DNases, RNases e materiais genéticos.

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Confira:

 

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Referências:

Zaha, A.; Ferreira, H. B.; Passaglia, L. M. P - Organizadores. Biologia molecular básica. 5ª ed. Artmed, 2014.

Alberts B.; Johnson A.; Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Walter P. Biologia molecular da célula. 5ª ed. Artmed, 2010.

Garibyan, L.; Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR), Journal of Investigative Dermatology, 133(3): e6, 2013.

Bustin, S., Benes, V., Nolan, T., & Pfaffl, M. Quantitative real-time RT-PCR – a perspective, Journal of Molecular Endocrinology, 34(3), 597-601, 2005.

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Figura 1: Etapas da PCR. A técnica de PCR envolve períodos de elevação e diminuição de temperatura realizados por um equipamento denominado termociclador. É a variação de temperatura que determina as atividades de cada ciclo de amplificação composto pelas etapas de desnaturação, anelamento e extensão das amostras de DNA presentes na reação, resultando em múltiplas cópias de regiões específicas.

Figura 2: Número de cópias de amplificadas em cada ciclo. Neste esquema está representado o número de cópias geradas em cada ciclo de amplificação a partir de apenas uma fita-dupla de DNA presente na amostra. Cada fita de DNA presente na reação será amplificada da mesma forma se apresentar a sequência reconhecida pelo primer.

 

Figura 1

Figura 2